Большое значение имели для него и полевые навыки, приобретенные в экспедиции 1961 г.на Кавказ, возглавлявшейся Е. В. Карасевой. По окончании университета , в 1964—1966 гг.,Е. Н. Матюшкин вместе с женой Л. В. Кулешовой, также выпускницей кафедры биогеографии, работал штатным научным сотрудником Сихотэ-Алинского государственного заповедника, с которым поддерживал тесные отношения и все последующие годы, продолжая там полевые исследования. Затем был в аспирантуре географического факультета МГУ, в 1970 г. защитил кандидатскую диссертацию на тему “Территориальные группировки млекопитающих Среднего Сихотэ-Алиня и вопросы формирования его териофауны”. Официальными оппонентами на защите выступали лидер отечественной экологии и экологической биогеографии проф. А. Н. Формозов, известный географ проф. Ю. А. Ливеровский, автор монографии “Природа южной половины Советского Дальнего Востока” (1949); отзыв учреждения-оппонента, Зоологического института АН СССР, готовил ведущий палеотериолог страны профессор Н. К. Верещагин. Оценка ими работы была единодушно высокой.

В период 1969—1983 гг. Е. Н. Матюшкин — сотрудник Отдела млекопитающих Зоологического музея (и одновременно — Лаборатории зоогеографии и систематики кафедры зоологии позвоночных биологического факультета) МГУ. До 1975 г. он работал здесь под непосредственным руководством выдающегося териолога, профессора В. Г. Гептнера, зоолога-эволюциониста, олицетворявшего в то время классическое направление зоогеографии в России; общение с ним существенно обогатило круг интересов Евгения Николаевича, кроме того, он прошел в Зоомузее практическую школу зоолога-систематика. В 1983 г. Е. Н. Матюшкин вернулся на кафедру биогеографии географического факультета, где работает в должности старшего научного сотрудника до настоящего времени.

Первая научная работа вышла в 1962 г. по материалам, собранным еще в экспедиции КЮБЗа 1958 г.; таким образом, научная деятельность Евгения Николаевича продолжается более 40 лет. Он автор 6 книг (считая соавторские) и более чем сотни статей в журналах и сборниках. Главный стержень научных интересов Е. Н. Матюшкина — зоогеография в широком ее понимании, что прослеживается и в тех его работах, которые формально зоогеографическими не являются. Студентам-старшекурсникам кафедры биогеографии он многие годы читал, частично продолжает читать и сейчас зоогеографические разделы курсов “Биогеография России и сопредельных стран”, “Историческая биогеография”, “География биологических ресурсов”, а также спецкурс “Экология копытных и хищных зверей”. Е. Н. Матюшкин привержен идеям синтетической зоогеографии, органически сочетающей подходы и методы как фауногенетического, так и экологического направлений этой науки, нередко без серьезных на то оснований противопоставляемых друг другу. Среди вопросов, особенно его привлекавших, — классификация географо-генетических элементов фауны, анализ взаимодействия их в сообществах, характеристика крупных типов разорванных ареалов в пределах Евразии, реконструкция их исторической динамики. Как самостоятельную проблему поставил Е. Н. Матюшкин изучение форм смешанности элементов различного происхождения в региональных и даже локальных фаунах. Географический район, послуживший для этого основным полигоном — юг Дальнего Востока, знаменитый Уссурийский край. Наиболее cущественные результаты его собственно зоогеографических исследований представлены в работах: “Смешанность териофауны Уссурийского края: ее общие черты, исторические корни и современные проявления в сообществах Среднего Сихотэ-Алиня” (1972), “Европейско-восточноазиатский разрыв ареалов наземных позвоночных” (1976), “Региональная дифференциация лесной фауны Палеарктики в прошлом и настоящем” (1982).

Как зоолог Е. Н. Матюшкин обращался к различным группам наземных позвоночных, включая птиц и млекопитающих различных отрядов, однако постепенно интересы его сосредоточились на хищных млекопитающих, прежде всего кошачьих, признанным знатоком которых он стал. Особенно много занимался он амурским тигром и рысью, которым посвятил большую серию работ, включая монографические. Эти звери интересовали его с различных сторон: от систематики до экологии и поведения их в природе. Выполненный им систематический обзор рысей мировой фауны (“Рыси Голарктики”, 1979) до сих пор остается наиболее фундаментальной и часто цитируемой работой в данной области. Здесь отличительная особенность подхода Е. Н. Матюшкина заключалась в том, что морфологическим признакам он стремился дать возможно более широкую биологическую интерпретацию. На материале по хищным млекопитающим продолжалась разработка зоогеографических идей, в частности он обратил внимание на замечательное явление асимметрии фрагментов ареалов голарктических видов хищников на двух северных континентах (“Особенности зонального распространения хищных млекопитающих в Евразии и Северной Америке”, 1988).

Занимаясь экологией хищных зверей в природе, Е. Н. Матюшкин следовал традициям отечественной натуралистической школы, идущим прежде всего от А. Н. Формозова: полевые наблюдения велись им главным образом в зимнее время, при этом он пользовался преимущественно методами тропления и учета зверей по следам на снегу. Сбору таких материалов было посвящено в общей сложности 27 зимних полевых сезонов в широком диапазоне географических районов — от Беловежской Пущи на западе до Сихотэ-Алиня на востоке, от северной подзоны европейской тайги на севере до Армянского нагорья и Тянь-Шаня на юге. В течение трех полевых сезонов (1998—1990 гг.) с использованием специально оборудованного для суровых зим экспедиционного автомобиля была обследована вся горно-лесная часть Монголии. По зимней тайге, преимущественно горной, им пройдены тысячи километров, в том числе многие сотни — по следам крупных хищных зверей. Среди объектов тропления в разные годы были помимо тигра, рыси, росомахи также харза, ирбис, волк. Для некоторых из перечисленных видов Е. Н. Матюшкиным при участии его ближайших коллег были впервые даны детальные описания их следов, сопровождаемые большим количеством фотографий и рисунков. Под его руководством и при его прямом участии зимой 1995—1996 гг. был проведен последний в прошедшем столетии учет амурского тигра на всей площади его ареала (см.: Матюшкин Е. Н., Пикунов Д. Г., Дунишенко Ю. М. и др. “Состояние ареала и численность амурского тигра на Дальнем Востоке России в середине 90-х гг.”, 1999). Свой многолетний опыт в области наблюдений и учетов по следам он обобщил в обстоятельной методической статье “Следы и метод тропления в изучении крупных хищных млекопитающих” (2000).

На протяжении многих лет, соприкасаясь с видами, имеющими статус редких или исчезающих, Е. Н. Матюшкин, естественно, сосредоточился на вопросах их охраны. Именно такой характер носила еще самая первая его публикация об амурском тигре (1966). Спустя многие годы он же возглавил авторский коллектив по подготовке специального, первого в серии ему подобных, детально разработанного документа “Стратегия сохранения амурского тигра в России” (1996); позднее участвовал в обсуждении и редактировании аналогичных “Стратегий”, посвященных дальневосточному леопарду и ирбису. С первых шагов своей научной деятельности и до настоящего времени он тесно связан с заповедниками России, посетил 14 из них, а также 8 в странах, ранее входивших в СССР. Руководил выполнением отдельных научно-исследовательских тем в заповедниках, участвовал в решении их насущных проблем. Многие годы сотрудничает в Комиссии по заповедному делу РАН. В самое последнее время им сделана попытка оценить современное состояние и перспективы “заповедной” науки в целом (“О приоритетах научных исследований в заповедниках России”, 2000).

Почти четверть века Е. Н. Матюшкин состоит членом редколлегии старейшего русского журнала “Бюллетень МОИП. Отдел биологический”, с 1981 го-да — заместитель главного редактора журнала, несущий ответственность за его зоологический раздел. За прошедшие десятилетия им отредактированы сотни статей, в том числе малоопытных авторов, обладающих интересными данными, рукописи которых требовали более чем серьезной правки. Таким образом, он содействовал публикации ценных материалов очень большого объема, которые без его участия вряд ли смогли бы увидеть свет. Его редакторская рука хорошо знакома многочисленным зоологам с разных концов огромной страны, в особенности из заповедников.